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土壤 抗生素类化合物的测定 超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法(征求意见稿

1 范围

      本文件规定了土壤中17种抗生素类化合物的超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱测定方法。   

      本文件适用于土壤中磺胺氯哒嗪、磺胺甲基嘧啶、磺胺对甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺吡啶、克拉霉素、脱水红霉素、北里霉素、罗红霉素、泰乐菌素、金霉素、土霉素、环丙沙星、诺氟沙星、甲氧苄氨嘧啶和林可霉素17种抗生素(见附录A)的定性和定量检测。

      当土壤干重为2.0 g,经提取、净化和浓缩全过程处理后,定容体积为1.0 ml,进样体积为10μl时,17种抗生素的方法检出限为0.9g/kg4.7g/kg,测定下限为3.6μg/kg19μg/kg。详见附录B

2 规范性引用文件

      下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注明日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注明日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

      HJ 613 土壤 干物质含量和水分的测定 重量法

      HJ/T 166 土壤环境监测技术规范

3 术语与定义

      本文件没有需要界定的术语和定义。

4 方法和原理

      过筛土壤以乙腈-McIlvaine缓冲液为提取剂,采用超声波辅助提取目标抗生素。提取液经固相萃取柱富集、净化、定容后,采用高效液相色谱-三重四极杆质谱检测。根据目标物的保留时间、特征离子对及其丰度定性,采用内标法定量。

5 干扰和消除

      四环素类抗生素可与土壤中的金属离子结合形成络合物,干扰提取过程,降低此类化合物的提取效率。在提取过程中,加入金属离子螯合剂乙二胺四乙酸四钠,可抑制金属离子的干扰。

6 试剂和材料

6.1 实验用水为新制备不含目标化合物的纯水。

6.2 硫酸:ρ (H2SO4) = 1.84 g/ml,分析纯。

6.3 氢氧化钠(NaOH):分析纯。

6.4 甲醇(CH3OH):色谱纯。

6.5 乙腈(CH3CN):色谱纯。

6.6 甲酸(HCOOH):色谱纯。

6.7 乙酸铵(CH3COONH4):色谱纯。

6.8 磷酸氢二钠十二水化合物(Na2HPO4·12H2O):分析纯。

6.9 柠檬酸一水化合物(C6H8O7·H2O):分析纯。

6.10 乙二胺四乙酸四钠(Na4EDTA):分析纯。

6.11 硫酸溶液:c (H2SO4)= 4.0 mol/L。量取 22 ml 硫酸(6.2),缓慢加入到纯水中,待温度降至室温后,用纯水定容到 100 ml。室温下保存期为 3 个月。

6.12 NaOH 溶液(1.0 mol/L):称取 4 g 氢氧化钠(6.3)溶于纯水中,定容至 100 ml。室温下保存期为 2 个月。

6.13 氢氧化钠的甲醇溶液:量取 1.0 ml 1.0 mol/L 的氢氧化钠溶液(6.12)溶于甲醇(6.4)中,定容至 200 ml。临用现配。

6.14 甲酸-乙酸铵的水溶液:量取 1.5 ml 甲酸(5.5)并称取 0.116 g 乙酸铵(6.7),溶于 750 ml 纯水中,制备成 0.2%V/V)甲酸-2.0 mmol/L 乙酸铵的水溶液。临用现配。

6.15 甲酸-乙酸铵-乙腈的混合液:分别量取 90 ml 甲酸-乙酸铵的水溶液(6.14)和 10 ml 乙腈(6.5), 混合并摇匀。临用现配。

6.16 磷酸氢二钠溶液(0.2 mol/L):称取 71.628 g 磷酸氢二钠十二水化合物(6.8)溶于纯水中,定容至 1000 ml。室温下保存期为 3 个月。

6.17 柠檬酸溶液(0.1 mol/L):称取 21.014 g 柠檬酸一水化合物(6.9)溶于纯水中,定容至 1000 ml。室温下保存期为 3 个月。

6.18 McIlvaine 缓冲液(pH = 4):分别量取 380 ml 磷酸氢二钠溶液(6.16)和 620 ml 柠檬酸溶液(6.17),混合并摇匀。室温下保存期为 3 个月。

6.19 乙腈-McIlvaine 缓冲液的混合液(1: 1V/V):分别量取 10 ml 乙腈(6.5)和 90 ml McIlvaine缓冲液(6.18),混合并摇匀。临用现配。

6.20 石英砂:粒径 150 250μm100 60 目)。使用前置于马弗炉中 450℃烘烤 4 h,冷却后装入磨口玻璃瓶中密封,于干燥器中保存。

6.21 抗生素标准储备液:ρ=100 mg/L(参考浓度)

      17种抗生素单标可直接购买市售有证标准溶液,也可用标准物质(纯度≥ 98%)制备。

      使用标准物质制备标准储备液的参考方法:准确称取10.0 mg抗生素标准物质,溶于100 ml甲醇(6.4) 中,最终浓度为100 mg/L;对于喹诺酮类抗生素,则溶于100 ml氢氧化钠的甲醇溶液(6.13)中。储备液应在-18 °C以下避光保存3个月或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温,并摇匀。

6.22 抗生素标准使用液:ρ=1.0 mg/L(参考浓度)

      将17种抗生素标准储备液(6.21)按需要用甲醇(6.4)稀释。标准使用液在−18℃以下避光保存3个月。使用时应恢复至室温,并摇匀。

6.23 内标物储备液:ρ=100 mg/L(参考浓度)

      8种抗生素内标物为环丙沙星-d8、脱水红霉素-13C-d3、林可霉素-d3、磺胺甲嘧啶-d4、磺胺二甲嘧啶-13C6、磺胺甲噁唑-d4、噻苯咪唑-d4、甲氧苄氨嘧啶-d3。可直接购买市售有证标准溶液,也可用标准物质(纯度≥ 95%)制备。储备液应在–18 °C以下避光保存3个月或参照制造商的产品说明。使用时应恢复至室温,并摇匀。每种抗生素对应的内标物详见附录A。其它符合内标物性质的化合物也能够使用。

6.24 内标物使用液:ρ=1.0 mg/L(参考浓度)

      取8种内标物储备液(6.23)按需要用甲醇(6.4)稀释。内标物使用液在−18 ℃以下避光保存3个月。使用时应恢复至室温,并摇匀。

6.25 离子交换柱:填料为高纯硅胶基质上键合三甲基氨丙基的强阴离子交换吸附剂(SAX)或其他等效   离子交换柱,参考规格为 500 mg/6 ml

6.26 固相萃取柱:填料为二乙烯苯和 N-乙烯基吡咯烷酮共聚物(HLB)或其他等效固相萃取柱,参考规格为 200 mg/6 ml

6.27 氮气:纯度≥ 99.99%

6.28 滤膜:0.22 μm 尼龙滤膜。

7 仪器和设备

7.1 棕色玻璃瓶:具塞磨口,250 ml

7.2 冷冻干燥机。

7.3 球磨机:配玛瑙球磨罐和不同尺寸的玛瑙球。

7.4 超声波装置:水槽式,超声波输出功率不小于 500 W,超声时间可调节。

7.5 离心机:4000 r/min 或以上。

7.6 固相萃取装置:流速可调节。

7.7 浓缩装置:氮吹浓缩仪或性能相当的设备。

7.8 高效液相色谱-三重四极杆质谱仪:配有电喷雾离子源(ESI)。

7.9 色谱柱:C18 或等效反相高效液相色谱柱,参考规格为 100 mm(长度)× 2.1 mm (内径)1.8 μm (填料粒径)

7.10 一般实验室常用仪器和设备。

8 样品

8.1 样品的采集与保存

      按照HJ/T 166的相关规定进行土壤样品的采集和保存。

      样品应保存在洁净的棕色玻璃瓶(7.1)中,运输过程中应避光冷藏。运回实验室后,在04 ℃避光保存,并于一周内完成样品前处理。

8.2 试样制备

8.2.1 样品预处理

      将新鲜土壤置于不锈钢或聚四氟乙烯盘中,除去树枝、叶子和石子等异物,混匀。取适量的混匀土   样,放入冷冻干燥机(7.2)中脱水。冻干后的样品用球磨机(7.3)或玛瑙研钵研磨充分后,过60目(孔   径0.25 mm)标准土壤筛,待提取。

8.2.2 提取

      称取2 g(精确到0.01 g)预处理后的土样(8.2.1)于50 ml聚丙烯离心管中,加入100l内标物使用液(6.24),混匀,于04 ℃避光保存12 h,待甲醇挥发。加入0.5 g乙二胺四乙酸四钠(6.10)和20 ml 乙腈-McIlvaine缓冲液的混合液(6.19),涡旋震荡20 s,再置于超声波中15 min4000 r/min室温下离心10 min,收集上清液。

重复提取一次,合并两次提取液,待后续处理。

8.2.3 净化

      以1000 ml纯水稀释提取液(8.2.2),并用4 mol/L硫酸(6.11)调节pH值至3左右。

      将SAX阴离子交换柱(6.25)与HLB固相萃取柱(6.26)首尾串联,固定在固相萃取装置(7.6)上。依次用10 ml甲醇(6.4)和10 ml纯水(6.1)活化萃取柱,保证柱头浸润。提取液以510 ml/min的流速通过小柱。待提取液全部通过小柱后,拆下SAX柱,用10 ml纯水淋洗HLB柱,去除小柱上的乙二胺四乙酸四钠(6.10)。真空抽滤使HLB柱干燥。用5 ml甲醇(6.4)以约0.5 ml/min的流速洗脱两次,收集全部洗脱液。

      注:固相萃取净化过程中宜用锡箔纸包裹固相萃取柱避光。

8.2.4 浓缩定容

      洗脱液(8.2.3)采用氮气(6.27)在40 °C下缓慢吹至近干,用甲酸-乙酸铵-乙腈的混合液(6.15) 定容至1.0 ml,尼龙滤膜(6.28)过滤后,待测。

8.3 空白试样

      以石英砂(6.20)代替实际样品,按照与试样制备(8.2)相同操作步骤,制备空白试样。

8.4 干物质含量测定

      另称取一份冷冻干燥后的样品进行干物质含量的测定,具体要求按照HJ 613执行。

9 分析步骤


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