警告：检测人员应采取必要的生物安全防护措施（包括但不仅限于一次性手套、口罩、防护服、防护眼镜、鞋套等防护用品）；检测时应做好无菌防护，在无菌操作设备内进行。
本标准规定了鉴定水中灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的生物学方法。
本标准适用于微生物实验室灭菌效果的评价。
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是注明日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本标准。凡是未注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
《消毒技术规范》（原卫生部卫法监发〔2002〕282 号）
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var. niger
也称萎缩芽孢杆菌（Bacillus atrophaeus），在含酪氨酸的培养基上形成黑色素的革兰氏阳性芽孢杆菌。作为灭菌效果评价试验的指示菌种。
3.2
灭菌 sterilization
物理或化学的方法杀灭全部微生物，包括致病和非致病微生物、芽孢和朊病毒蛋白，使之达到无菌保障水平。常用的灭菌方法有化学试剂灭菌（如环氧乙烷、甲醛等）、射线灭菌（如γ射线、电子束辐射等）、湿热灭菌、干热灭菌和过滤除菌等。
3.3
生物指示物 biological indicator
含有对特定灭菌过程具有一定耐受力的活微生物的生物制品。
注：生物指示物为特定灭菌过程是否满足杀灭指定数量微生物的必须条件提供信息，并规定该过程的置信水平。
经灭菌处置后含枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢的水样通过孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸琼脂培养基上，36 ℃±1 ℃培养 72 h～96 h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解并利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检后通过生化试验做进一步鉴定，能利用甘油和甘露糖，可还原硝酸盐和水解淀粉，不能利用苦杏仁苷和甘露醇，并确认为革兰氏阳性芽孢杆菌的特征菌落为枯草芽孢杆菌黑色变种，鉴定结果为阳性。
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水为蒸馏水。
5.1 酪氨酸琼脂培养基，见附录 A.1。
5.2 营养琼脂培养基，见附录A.2。
5.3 淀粉培养基和碘液，见附录 A.3。
5.4 硝酸盐还原培养基和相关试剂，见附录A.4。
5.5 甘油复红肉汤培养基，见附录A.5。
5.6 甘露糖生化培养基，见附录 A.6。
5.7 甘露醇生化培养基，见附录 A.6。
5.8 苦杏仁苷生化培养基，见附录A.7。
5.9 革兰氏染色液，见附录 A.8。
5.10 芽孢染色液，见附录 A.9。
5.11 阴性对照菌：如地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）。
5.12 阳性对照菌：枯草芽孢杆菌黑色变种（Bacillus subtilis var. niger）。
5.13 枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液：按照《消毒技术规范》2.1.1.2.3（2）的规定制备，也可购买浓度范围在 106 CFU/ml～109 CFU/ml 之间的市售枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液。
5.14 无菌滤膜：直径 50 mm，孔径 0.45 μm 的醋酸纤维滤膜。
按无菌操作要求包扎，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需换水洗涤 2～3 次。也可采用市售的无菌滤膜。
5.15 石蜡质封口膜。
5.16 无菌水：取适量实验用水，经 121 ℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。
注 1：5.1～5.10 的成分及制备方法见附录 A，也可使用市售商品化培养基或染色液；
注 2：5.11～5.12，建议购买由国内或国际菌种保藏机构保藏的遗传学特性得到确认和保证并可追溯的标准菌株。
6.1 样品瓶：螺口带盖或磨口具塞的 250 ml、500 ml 广口玻璃瓶。
6.2 恒温培养箱：36 ℃±1 ℃。
6.3 高压蒸汽灭菌器：121 ℃，可调。
6.4 pH 计：准确到 0.1 pH 单位或更高精度。也可使用 pH 精密试纸。
6.5 显微镜：物镜 4×或 5×、10×、20×、40×，油镜 100×，目镜 10×或 15×。
6.6 分析天平：实际分度值 0.0001g。
6.7 培养皿：直径 90 mm。
6.8 过滤装置：配有砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗和真空泵，抽滤压力不低于-50 kPa。
6.9 接种环：直径 1 mm～3 mm。
6.10 镊子：不锈钢或一次性无菌塑料镊子。
6.11 刻度移液管：1 ml、10 ml。也可使用可调式移液器。
6.12 量筒：100 ml。
6.13 锥形瓶：100 ml。
6.14 酒精灯。
6.15 试管：10 ml。
6.16 无菌操作设备：无菌室、超净工作台、生物安全柜。
6.17 一般实验室常用仪器和设备。
注：试验前，移液管、样品瓶、培养皿、锥形瓶、试管、砂芯滤器、圆筒形玻璃漏斗等玻璃器皿应按无菌操作要求包扎，高压蒸汽灭菌器（6.3）中 121℃灭菌 20 min，烘干，备用。也可采用干热灭菌（135℃～140 ℃灭菌 3 h～5 h，或 160℃～170℃灭菌 2 h～4 h，或 180℃～200℃灭菌 0.5h～1h）。
7.1 样品采集
7.1.1 评价使用高温高压灭菌设备的灭菌效果时，取样品瓶（6.1），加入枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13）及 200 ml 无菌水（5.16）使混合液中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到 5×104 CFU/ml～ 5×105 CFU/ml。灭菌处置完毕后，取出样品瓶，对水样进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种） 的检测。
7.1.2 评价使用其它灭菌设备的灭菌效果时，灭菌前取适量枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢悬液（5.13）加入灭菌设备，使水样中枯草芽孢杆菌黑色变种芽孢终浓度达到 5×104 CFU/ml～5×105 CFU/ml。灭菌处置完毕后，从灭菌设备中采集水样，进行灭菌生物指示物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的检测。采样量一般为样品瓶容量的 80%左右，不得用样品洗涤样品瓶。样品采集完毕后，迅速用无菌包装纸包扎样品瓶。
7.2 样品保存
样品采集后宜在 2 h 内检测，否则应在 10 ℃以下冷藏保存运输，但不得超过 6 h。实验室接收样品后，不能立即开展检测的，样品应在 4 ℃以下冷藏保存，并在 2 h 内检测。
注：宜使用生物安全周转箱进行样品周转。
8.1 方法程序
样品中枯草芽孢杆菌黑色变种的检测程序见图 1。
8.2 样品过滤
用无菌镊子（6.10）以无菌操作夹取无菌滤膜（5.14）贴放在已灭菌的过滤装置（6.8）上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取 100 ml 抽滤，以无菌水（5.16）冲洗滤器内壁 2～3 次。
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