1 范围
本标准规定了化妆品中九种四环素类抗生素的高效液相色谱测定方法。
本标准适用干皮肤护理类化妆品中九种四环素抗生素的测定。
2 原理
3 试剂和材料
除另有规定外试剂均为分析纯
3.1 甲醇色谱纯
3.2 乙腈色谱纯
3.3 九种四环素纯度不小于97.0％；土霉素，纯度不小于97.9%；金霉素纯度不小于99.0％；多西环素，纯度不小于96.5%；美他环素，纯度不小于99.6%．去甲基金霉素纯度不小于99.0％；二甲胺四环素，纯度不小于99.0%；脱水四环素纯度不小于90.0％；差向脱水四环素，纯度不小于90.0%。
3.4 九种四环素类抗生素标准储备液；准确称取各类四环素(3.3)0.1g,精确到0000 1g,分别置于 50mL烧杯中加适量甲醇溶解溶液定里移入100 mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度，混匀即得浓度为1 000 mg/L的标准储备液。
3.5 九种四环素类抗生素标准工作溶液用甲醇将上述混合标准储备液（3.5）分别配成一系列浓度为1m g/L、2 mg/L、5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的标准工作溶液，冰箱冷藏保存，可使用一周。
3.6 0.01 moI/L草酸溶液:称取草酸（C2H2O4▪2H2O）1.26 g，精确至0.001 g,于50 mL烧杯中加水溶解后移入1 000mL容量瓶中用水定容至刻度，混匀，即得0.30 mol/L的草硅溶液。
4 仪器
4.1 液相色谱仪配有二极粉阵列检侧器。
4.2 徽量进样器10μL。
4.3 超声波清洗器
4.4 离心机，大于5 000 r/min。
4.5 溶剂过滤器和0.45 μm有机过滤膜。
本标准二甲胺四环素的检出限为25 mg/kg,土霉素、四环素、去甲基金霉素的检出限为10 mg/kg, 金霉素、美他环素、多西环素的检出限为5 mg/kg，差向脱水四环素和脱水四环素的检出限为2.5 mg/kg。
二甲胺四环素的定量限为50 mg/kg，土霉素、四环素、去甲基金霉素的定量限为25 mg/kg，金霉素、美他环素、多西环素的定量限为10 mg/kg，差向脱水四环素和脱水四环素的定虽限为5 mg/kg。
以甲醇为溶剂，超声提取、离心，0.45 μm的有机滤膜过滤，溶液注入配有二极管阵列检侧器 (DAD)的液相色谱仪检测，外标法定量。
九种四环素类抗生素混合标准储备液分别移取上述标准储备液(3.4)各10 mL至100ml容量瓶中,用甲醇定容至刻度即得浓度为100 mg/L的标准混合储备液。
5.1 样品处理
称取化妆品试样约0.2g，精确到0. 001g，于10 mL具塞比色管中，加人约8 mL甲醇，在超声波清洗器中超声振荡30min，冷却至室温后，加甲醇定容至刻度。取部分溶液放人离心管中，在离心机上于5000 r/min离心20min，离心后的上清液经0.45μm有机滤膜过滤，滤液供测定用。
5.2 测定
5.2.1 色谱条件
5.2.1.1 色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm（内径）,5 μm，或相当者）。
5.2.1.2 流动相：A：甲醇与乙睛的混合溶液(1+3,V/V) ,B:0. 01 mol/L的草酸溶液（3. 7)，梯度洗脱条件见表1。
5.2.1.4 检测波长：程序可变波长：0~4.00 min为350 nm,4.01 min-12.00 min为270 nm。
5.2.1.5 柱温：25℃。
5.2.1.6 进样量：10μL,
5.2.2 标准工作曲线绘制
分别移取一系列浓度为1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L的标准工作溶液，按色谱条件（5.2.1)进行测定，记录色谱峰面积，以色谱峰的峰面积为纵坐标，对应的溶液浓度为横坐标作图，绘制标准工作曲线。
九种四环素的标准液相色谱图参见附录A的图A.1。
5.2.3 试样测定
用微量注射器吸取试样溶液（5. 1)注人液相色谱仪，按色谱条件（5. 2. 1)进行测定，记录色谱峰的保留时间和峰面积，由色谱峰的峰面积可从标准曲线上求出相应的浓度。样品溶液中的被测物响应值均应在仪器测定的线性范围之内。含量高的试样可取适量试样溶液用流动相稀释后进行测定。
5.2.4 定性确认
液相色谱仪对样品进行定性测定，进行样品测定时，如果检出四环素类抗生素的色谱峰的保留时间与标准品相一致，并且在扣除背景后的样品色谱图中，该物质的紫外吸收图谱与标准品的紫外吸收图谱相一致，则可初步确认样品中存在被测四环素类抗生素。必要时，阳性样品需用其他方法进行确认试验。
5.3 平行试验
按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。
5.4 空白试验
除不称取试样外，均按上述步骤进行。
6 结果计算
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