警告：操作时应按要求佩戴防护器具，做好无菌防护；实验室操作需在无菌操作设备内进行，避免吸入呼吸道或接触皮肤和衣物。
1 适用范围
本标准规定了鉴定水中灭菌指示微生物的生物学检测方法。
本标准适用于经灭菌处置的废水中指示微生物（枯草芽孢杆菌黑色变种）的鉴定。
2 规范性引用文件
本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和实验方法
HJ 494 水质 采样技术指导
HJ/T 91 地表水和污水监测技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
枯草芽孢杆菌黑色变种 Bacillus subtilis var. niger
在含酪氨酸的培养基上形成黑色色素的革兰氏阳性芽孢杆菌，其营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，还原硝酸盐，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。
4 方法原理
灭菌处置后的废水通过孔径为 0.45 μm 的滤膜过滤，细菌和芽孢被截留在滤膜上，然后将滤膜置于酪氨酸选择性培养基上，37℃培养 72 h～96 h，枯草芽孢杆菌黑色变种产生的酪氨酸酶可分解利用酪氨酸形成黑色素，产生黑色的特征菌落。对特征菌落进行染色镜检和生化试验做进一步鉴定，枯草芽孢杆菌黑色变种为革兰氏阳性芽孢杆菌，营养细胞呈杆状，单个或呈短链状排列，芽孢椭圆形，中生，不膨大，能利用甘油、甘露糖，还原硝酸盐，水解淀粉，不能利用苦杏仁苷、甘露醇。根据结果报告检出或未检出枯草芽孢杆菌黑色变种。
5 干扰和消除
5.1 活性氯具有氧化性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1） 时加入硫代硫酸钠溶液（6.13）消除干扰。
5.2 重金属离子具有细胞毒性，能破坏微生物细胞内的酶活性，导致细胞死亡，可在样品采集（8.1）时加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.14）消除干扰。
6 试剂和材料
除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂，实验用水应满足 GB/T 6682中三级水的要求。
6.1 酪氨酸琼脂培养基。
6.2 营养琼脂培养基。
6.3 淀粉培养基。
6.4 硝酸盐培养基。
6.5 甘油复红肉汤培养基。
6.6 甘露糖生化培养基。
6.7 甘露醇生化培养基。
6.8 苦杏仁苷生化培养基。
6.9 革兰氏染色液。
6.10 芽孢染色液。
注：6.1～6.10 的成分及制法详见附录 A，其中 6.2～6.10 也可使用市售商品化培养基或试剂。
6.11 硫代硫酸钠（Na2S2O3·5H2O）。
6.12 乙二胺四乙酸二钠（C10H14N2O8Na2·2H2O）。
6.13 硫代硫酸钠溶液：ρ(Na2S2O3)=0.10g/ml。
称取 15.7g 硫代硫酸钠（6.11），溶于适量水中，定容至 100 ml，临用现配。
6.14 乙二胺四乙酸二钠溶液：ρ(C10H14N2O8Na2·2H2O)=0.15 g/ml。
称取 15 g 乙二胺四乙酸二钠（6.12），溶于适量水中，定容至 100 ml，此溶液保质期为 30 d。
6.15无菌滤膜：直径 50mm，孔径 0.45 μm 的醋酸纤维滤膜。
按无菌操作要求包扎，经 121℃高压蒸汽灭菌 20min，晾干备用；或将滤膜放入烧杯中，加入实验用水，煮沸灭菌 3 次，15 min/次，前 2 次煮沸后需更换水洗涤 2～3 次。
6.16 石蜡质封口膜。
6.17 无菌水：取适量实验用水，经 121℃高压蒸汽灭菌 20 min，备用。
7 仪器和设备
7.1 采样瓶：具螺旋帽或磨口塞的 500 ml 广口玻璃瓶。
7.2 恒温培养箱：允许温度偏差 36℃±1℃。
7.3 高压蒸汽灭菌器：121℃可调。
7.4 pH 计：准确到 0.1pH 单位，或更高精度。也可使用 pH 比色管或pH 精密试纸。
7.5 显微镜：物镜 10×倍、20×倍、40×倍，油镜 100×倍，目镜 10×倍或 15×倍。
7.6 分析天平：感量 0.0001 g。
7.7 培养皿：直径 90 mm。
7.8 过滤装置：配有砂芯滤器和真空泵，抽滤压力勿超过-50kPa。
7.9 接种环。
7.10 镊子。
7.11 移液管：1 ml±0.01 ml、10 ml±0.1 ml。也可使用计量合格的可调式移液器。
7.12 量筒：100 ml。
7.13 三角瓶：100 ml。
7.14 酒精灯。
7.15 无菌操作设备：无菌室或超净工作台、生物安全柜。
注：移液管、采样瓶、培养皿、三角瓶等玻璃器皿试验前要按无菌操作要求包扎，高压蒸汽灭菌器（7.3）121℃灭菌 20 min，烘干，备用。
8 样品
8.1 样品采集
点位布设及采样频次按照 HJ/T 494 和HJ/T 91 的相关规定执行。
采集微生物样品时，采样瓶（7.1）不得用样品洗涤，采集样品于灭菌的采样瓶中。
如果采集的是含有活性氯的样品，需在采样瓶灭菌前加入硫代硫酸钠溶液（6.13），以除去活性氯对细菌的抑制作用（每 125 ml 容积加入 0.1 ml 的硫代硫酸钠溶液）；如果采集的是重金属离子含量较高的样品，则在采样瓶灭菌前加入乙二胺四乙酸二钠溶液（6.14），以消除干扰（每 125 ml 容积加入 0.3 ml 的乙二胺四乙酸二钠溶液）。
注：15.7 mg 硫代硫酸钠（6.11）可去除样品中 1.5 mg 活性氯，硫代硫酸钠用量可根据样品实际活性氯量调整。
8.2 样品保存
采样后应在 2 h 内检测，否则，应 10℃以下冷藏但不得超过 6 h。实验室接样后，不能立即开展检测的，将样品于 4℃以下冷藏并在 2 h 内检测。
9 分析步骤
9.1 方法程序
样品中枯草芽孢杆菌黑色变种的鉴定程序见下图 1。
注：“＋”表示反应结果阳性，“－”表示反应结果阴性。
图 1 枯草芽孢杆菌黑色变种检测流程
9.2 样品过滤
用灭菌镊子（7.10）以无菌操作夹取无菌滤膜（6.15）贴放在已灭菌的过滤装置（7.8） 上，固定好过滤装置。将样品充分混匀后取 100 ml（高浓度样品可减少过滤样品量或将样品稀释）抽滤，以无菌水（6.17）冲洗器壁 2～3 次。样品过滤完成后，再抽气约 5 s，关上开关。
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