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《土壤 抗生素类化合物的测定 超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法(征求意见稿)》 编制说明

1. 项目背景

1.1 任务来源

      近年来,土壤环境中抗生素的污染问题受到研究人员、政府部门和大众的广泛关注。广东省政府对土壤中抗生素的污染非常重视,为配合贯彻《广东省土壤污染防治行动计划实施方案》,规范土壤环境中抗生素的检测方法,特制定本标准。

      根据《广东省市场监督管理局关于批准下达省地方标准制修订计划项目的通告》(2019 年第 7 ),广东省环境监测中心、华南师范大学环境研究院负责起草《土壤 抗生素类化合物的测定 超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法》。

1.2 工作过程

1.2.1 成立标准编制工作小组

      根据 2019 1 7 日发布的《广东省市场监督管理局关于批准下达省地方标准制修订计划项目的通告》(2019 年第 7 ),广东省环境监测中心和华南师范大学环境研究院接到制定《土壤 抗生素类化合物的测定  超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法》的任务后,成立标准编制工作小组,由从事多年抗生素研究经验、熟悉样品前处理、液相色谱-质谱联用仪的技术人员承担本工作。

1.2.2 查询国内外相关标准和文献资料

      2019 1 月,标准编制工作组根据有关标准制修订工作管理办法的相关规定, 检索、查询和收集国内外相关标准和文献资料。调研发现,国内外抗生素的检测方法有微生物法、酶联免疫吸附法、气相色谱法、毛细管电泳检测技术法、液相色谱法、液相色谱与质谱联用技术等。微生物法和酶联免疫吸附法等检测技术存在费时、抗体制备不易、敏感性差、假阳性率高等缺点;气相色谱法和毛细管电泳检测技术则受限于抗生素的非挥发或热不稳定性以及不同环境中电荷性质的差异性等而不适宜于抗生素的大量检测。近来越来越多的文献研究结果表明,高效液相色谱-串联质谱法(以下简称 LC-MS/MS)是一种高效、准确和灵敏的抗生素检测方法。但是,目前国内暂无采用 LC-MS/MS 测定土壤环境中抗生素的相关标准。

1.2.3 确定标准制订技术路线,制订原则

      2019 1 月至 3 月,确定了本标准的具体内容、原则、技术路线等内容。根据我国抗生素的使用量、土壤中常见抗生素的检出情况等资料,确定了我国常用的 17 种抗生素为目标物质,包括 6 种磺胺类、2 种氟喹诺酮类、5 种大环内酯类、2 种四环素类、林可霉素和甲氧苄氨嘧啶,采用超声辅助提取-固相萃取柱净化-LC-MS/MS 法分析的技术方案,实现对不同性质土壤中痕量抗生素的高效、准确测定。

1.2.4 实验室内部方法开发

      2019 4 月至 9 月,标准编制组采用超声辅助提取-固相萃取柱净化-LC-MS/MS 分析的方法,在华南师范大学环境研究院广东省化学品污染与环境安全重点实验室内部开展了检出限、精密度、准确度、方法适用性等系列的方法开发工作。实验结果表明,当土壤干重为 2.0 g,经提取、净化和浓缩后定容体积为 1.0 ml,进样体积

10μl 时,17 种抗生素的方法检出限为 0.6μg/kg4.7μg/kg,测定下限为 2.4μg/kg 19 μg/kg。可实现土壤中痕量抗生素的定量分析。

1.2.5 编写标准文本和编制说明初稿

      2019 10 月至 12 月,标准编制工作小组汇整前期研究成果,编写标准草案及编制说明。

1.2.6 开展方法验证工作

      2020 5 月至 8 月,标准编制工作组确定了外部 6 家实验室进行方法验证,于2020 9 月收回全部的验证报告,在此基础上进行了数据的汇总和分析整理工作, 并编写完成了验证汇总报告。

1.2.7 编写标准文本(征求意见稿)和编制说明

      2020 9 月至 11 月,标准编制工作组编写《土壤 抗生素类化合物的测定 超声提取-固相萃取-高效液相色谱-串联质谱法(讨论稿)》的标准文本及编制说明, 并于 2020 11 3 日组织专家对标准文本(讨论稿)及编制说明进行了初步论证。根据专家意见进一步修改,形成标准文本(征求意见稿)及编制说明。

2 标准制修订的必要性

2.1 目标污染物的环境危害

2.1.1 目标污染物的基本性质

      抗生素是由微生物(细菌、真菌和放线菌) 在生长代谢过程中产生或由人工合成或半合成的,能抑制微生物生长的小分子化合物。由于抗生素在人类临床疾病治疗和畜牧水产业中的广泛应用,自 1929 年英国科学家弗莱明发现青霉素以来,随着科技的进步,不断有新的抗生素被发现或合成,抗生素队伍得以不断壮大,至今已达上万种,不仅包括微生物产生的,也包括高等动植物产生的代谢物以及用化学方法合成和半合成的化合物;不仅包括抗细菌的物质,也包括抗肿瘤、抗原虫、抗病毒、抗真菌、抗藻类、抗寄生虫等的物质。

      目前常见的抗生素类型主要有:

      (1) 磺胺类:磺胺类药物是应用最早的一类人工合成抗菌药物。磺胺类药物属于 广谱抗菌药物,因其抗菌谱广、疗效强、方便安全等优点被广泛用于人体和动物(各 种畜禽、水产和宠物)  。常见的磺胺类药物主要有磺胺嘧啶、磺胺甲噁唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺二甲嘧啶、复方新诺明(磺胺甲噁唑+甲氧苄氨嘧啶) 等。磺胺的分子中含有一个苯环,一个对位氨基和一个磺酰胺基。磺胺类化学物主要是 通过各种化学基团来取代磺酰胺基上的氢原子制备的有效衍生物(1)


​​图 1 主要的抗生素种​

(2) 四环素类:四环素是一类被广泛使用的广谱抗生素,能通过与核糖体 30S 亚基结合,阻止氨酰-tRNA 与核糖体结合而抑制细菌蛋白质的合成。四环素类抗生素可与 Ca2+Mg2+Fe2+Al3+等金属离子形成络合物,影响药效。同时与 Ca2+形成的不溶络合物会影响小儿的牙齿变黄和骨骼发育,因此小孩和孕妇禁用四环素类抗生素。常见的四环素类抗生素有金霉素、土霉素、强力霉素、甲烯土霉素、甘氨酰环素等。目前,四环素类抗生素多用于养殖业,如养猪、养鸡和水产养殖等。

      (3) 喹诺酮类:喹诺酮类药物是一类 4--1,4-二氢喹诺酮为原始骨架的人工合成抗生素。喹诺酮类药物通过在 DNA 解链阶段俘获细菌型 IIA 拓扑异构酶、DNA 旋转酶和拓扑异构酶 IV 而对染色体拓扑异构化产生干扰,阻滞 DNA 单链部分的复性,从而抑制细菌 DNA 的复制而发挥抑菌作用。自 20 世纪 60 年代萘啶酸、吡咯酸、恶喹酸等的发现开始,喹诺酮药物已发展至第四代,抗菌活性逐渐增强,副作用降低。现已被广泛用于人畜疾病治疗,常用的主要为第三代喹诺酮类,如环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、恩诺氟沙星和培氟沙星等。该类物质相对较稳定,水溶性偏低。

      (4)β-内酰胺类:β-内酰胺类是一类含有β-内酰胺环的抗生素,其通过抑制革兰氏阴性细菌细胞壁合成的最后一步而对细菌产生抑制作用。该类抗生素具有杀菌活性强、药物代谢动力学性质良好、低宿主毒性以及与其它种类抗生素(例如氨基糖苷类) 协同增效等优点,因此被广泛应运于临床和畜牧业中。青霉素类水溶液不稳定, 极易失效;不耐热;酸、碱、重金属及青霉素酶可使其β-内酰胺环破裂,导致失效。常用的有青霉素、苯唑西林、氨苄西林、阿莫西林、头孢氨苄、头孢唑林、头孢他啶、头孢噻肟等。

      (5)大环内酯类:大环内酯类抗生素是一类具有大环内脂结构,可抑制大多数革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱一线抗生素。大环内酯类通过与细菌核糖体 50S 亚基可逆性结合,抑制蛋白质的合成,发挥抑菌活性。常见的大环内酯类抗生素有红霉素 A、阿奇霉素、泰乐菌素、竹桃霉素和北里霉素。

      (7)多肽类:多肽类抗生素是一类具多肽结构特征的抗生素,通过作用于细菌的渗透压屏障,损伤细胞质膜而对细菌产生抑制,可分为多黏菌素类、糖肽类和杆菌肽类。通常被用作抵抗革兰氏阳性菌的最后一道防线。常见的多肽类抗生素有多黏菌素 B、杆菌肽、短杆菌肽、万古霉素、替考拉宁、奥利万星、达巴万星、特拉万星、氯依瑞霉素等。

      (8)林可酰胺类:林可酰胺类化学结构主要由氨基酸和寡糖构成,其主要作用机制为与核糖体 50S 亚基结合抑制肽链的生成,主要针对厌氧细菌和原生动物感染。易引发恶心、呕吐、腹泻、皮疹、发烧等不良反应,很少用于临床医疗,主要与大观霉素联合用于反刍动物、猪和禽类。该类抗生素中的细菌自然代谢生成的代表有林可霉素和天青霉素,其半合成的代表有克林霉素和吡利霉素。

      (9)氯霉素类:氯霉素是一种对多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的广谱抗生素, 氯霉素主要抑菌机理为通过与原核细胞中 50S 核糖体亚基结合,抑制蛋白质的合成而阻止细菌繁殖。氯霉素分子主要由对硝基苯基、丙二醇与二氯乙酰胺三个部分组 成,性质稳定。氯霉素类能引发多种严重的副作用,例如骨髓抑制、再生性障碍贫血、血小板减少症和粒细胞减少等,故中国、日本、加拿大、美国和澳大利亚等国 家现已明令禁止其使用。常见的氯霉素类抗生素有氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考等。

 

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